制作石蜡切片的步骤与方法

怎样制作石蜡切片

石蜡切片是生物学、医学和植物学等领域中常用的技术，用于制备组织和细胞的显微切片，以便进行观察和分析。该技术通过一系列步骤，将新鲜组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固，从而制成可以用于显微镜观察的切片。以下是详细的制作石蜡切片的步骤和注意事项。

一、材料和设备准备

制作石蜡切片首先需要准备一系列的材料和设备，包括固定液、脱水剂、透明剂、石蜡、切片工具、染色剂和封固剂等。

试剂和材料：

固定液：常用10%甲醛水溶液，也可以采用FAA固定液（50%或70%酒精90ml，冰醋酸5ml，福尔马林5ml）。

脱水剂：70%、85%、95%、100%酒精。

透明剂：二甲苯。

石蜡：熔点根据季节和材料的硬度选择，常用熔点为54-62℃的石蜡。

染色剂：番红、固绿、苏木精和伊红等。

封固剂：中性树胶或加拿大树胶。

其他：蛋白甘油（用于防止切片脱片）、明胶（用于粘片）。

仪器和设备：

石蜡切片机：用于将包埋好的组织块切成薄片。

组织脱水机：用于自动脱水过程，适合大量样品。

展片台和恒温箱：用于展片和烤片。

染色缸：用于染色过程。

载玻片和盖玻片：用于承载和覆盖切片。

烧杯、量筒、滴管等玻璃器皿：用于试剂配制和混合。

二、取材与固定

1. 取材：

根据需要观察的部位选择适当的组织，取材要迅速，防止组织细胞发生变化。

样品体积应适中，不宜过大或过小，以免影响后续处理。

2. 固定：

将切好的组织块立即浸入固定液中，常用的固定液是10%甲醛水溶液。

固定时间可以根据材料的种类和厚度进行调整，一般在数小时到数天之间。

固定后的组织应保存在阴凉处，并贴好标签，注明固定液、材料来源和日期等信息。

三、脱水与透明

1. 脱水：

组织固定后，需要用酒精进行逐级脱水，从低浓度到高浓度逐步进行（70%→85%→95%→100%）。

每一步脱水时间一般在1-2小时，确保组织中的水分完全脱净，但也不能过度脱水导致组织变脆。

2. 透明：

脱水后的组织需要用二甲苯进行透明处理，使二甲苯能够完全替换组织中的酒精。

透明过程需要逐步进行，先用二甲苯与酒精的等体积混合液，再用纯二甲苯进行两次处理。

每次透明时间一般在1小时左右，确保组织完全透明。

四、浸蜡与包埋

1. 浸蜡：

透明后的组织需要浸入融化的石蜡中，使石蜡能够完全渗透到组织内部。

浸蜡过程需要逐步进行，先用二甲苯和石蜡的混合液，再逐步增加石蜡的比例，直至完全用纯石蜡浸透。

浸蜡温度要恒定，一般在36-60℃之间，浸蜡时间根据组织大小和硬度而定，一般需要12-24小时。

2. 包埋：

浸蜡后的组织块用石蜡进行包埋，使其形成一个固定的蜡块。

包埋时需要注意蜡块的形状和大小，以便后续切片。

包埋后的蜡块需要冷却凝固，然后才能进行切片。

五、切片与贴片

1. 切片：

将包埋好的蜡块用石蜡切片机切成薄片，切片厚度一般在5-20μm之间。

切片时需要保持切片机的刀片锋利，以确保切片质量。

切片后需要用毛笔将切片转移到载玻片上，或者用拨针等工具辅助贴片。

2. 贴片：

切片贴片前，需要在载玻片上涂抹粘片剂（如明胶），以防止切片在后续操作中脱落。

贴片后需要将载玻片放在展片台上，用恒温箱烤干，使切片牢固地粘附在载玻片上。

六、脱蜡与复水

1. 脱蜡：

干燥后的切片需要先用二甲苯进行脱蜡处理，使切片中的石蜡完全去除。

脱蜡过程需要逐步进行，先用二甲苯与酒精的混合液，再用纯二甲苯进行多次处理。

每次脱蜡时间一般在5-10分钟之间，确保切片完全脱蜡。

2. 复水：

脱蜡后的切片需要逐步经过不同浓度的酒精进行复水处理，使切片能够重新吸收水分。

复水过程需要逐步进行，从高浓度到低浓度逐步进行（100%→95%→85%→70%）。

每一步复水时间一般在5-10分钟之间，确保切片完全复水。

七、染色

1. 染色剂的选择：

根据需要观察的组织结构和细胞类型选择合适的染色剂。

常用的染色剂有苏木精-伊红染色法（HE染色法）、番红-固绿染色法等。

2. 染色过程：

将复水后的切片放入染色缸中，加入适量的染色液进行染色。

染色时间根据染色剂的种类和浓度、室内温度等因素进行调整。

染色后需要用蒸馏水或酒精进行漂洗，去除多余的染色液。

八、封固

1. 脱水：

染色后的切片需要再次用酒精进行脱水处理，以去除切片中的水分。

脱水过程需要逐步进行，从低浓度到高浓度逐步进行（70%→85%→95%→100%）。

每一步脱水时间一般在5-10分钟之间，确保切片完全脱水。

2. 封固：

脱水后的切片需要在载玻片上滴加适量的中性树胶或加拿大树胶进行封固。

封固前需要将切片上的多余液体吸干，以免影响封固效果。

封固后的切片需要放在恒温箱中干燥过夜，使树胶完全凝固。

九、镜检与保存

1. 镜检：

封固后的切片可以在显微镜下进行观察和分析。

观察时需要选择合适的放大倍数和视野，以便清晰地看到组织结构和细胞类型。

2. 保存：

合格的切片需要贴上标签，注明切片来源、染色方法和日期等信息。

切片需要保存在干燥、阴凉、避光的地方，以免受潮和变质。

制作石蜡切片是一项复杂而细致的工作，需要熟练掌握每一步骤和操作技巧。通过合理的取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固等步骤，可以制作出高质量的石蜡切片，为生物学、医学和植物学等领域的研究提供有力的支持。